The isolation of pentose-assimilating yeasts and their xylose fermentation potential

ABSTRACT For the implementation of cellulosic ethanol technology, the maximum use of lignocellulosic materials is important to increase efficiency and to reduce costs. In this context, appropriate use of the pentose released by hemicellulose hydrolysis could improve de economic viability of this process. Since the Saccharomyces cerevisiae is unable to ferment the pentose, the search for pentose-fermenting microorganisms could be an alternative. In this work, the isolation of yeast strains from decaying vegetal materials, flowers, fruits and insects and their application for assimilation and alcoholic fermentation of xylose were carried out. From a total of 30 isolated strains, 12 were able to assimilate 30 g L-1 of xylose in 120 h. The strain Candida tropicalis S4 produced 6 g L-1 of ethanol from 56 g L-1 of xylose, while the strain C. tropicalis E2 produced 22 g L-1 of xylitol. The strains Candida oleophila G10.1 and Metschnikowia koreensis G18 consumed significant amount of xylose in aerobic cultivation releasing non-identified metabolites. The different materials in environment were source for pentose-assimilating yeast with variable metabolic profile.

The isolation of pentose-assimilating yeasts and their xylose fermentation potential.

For the implementation of cellulosic ethanol technology, the maximum use of lignocellulosic materials is important to increase efficiency and to reduce costs. In this context, appropriate use of the pentose released by hemicellulose hydrolysis could improve de economic viability of this process. Since the Saccharomyces cerevisiae is unable to ferment the pentose, the search for pentose-fermenting microorganisms could be an alternative. In this work, the isolation of yeast strains from decaying vegetal materials, flowers, fruits and insects and their application for assimilation and alcoholic fermentation of xylose were carried out. From a total of 30 isolated strains, 12 were able to assimilate 30gL-1 of xylose in 120h. The strain Candida tropicalis S4 produced 6gL-1 of ethanol from 56gL-1 of xylose, while the strain C. tropicalis E2 produced 22gL-1 of xylitol. The strains Candida oleophila G10.1 and Metschnikowia koreensis G18 consumed significant amount of xylose in aerobic cultivation releasing non-identified metabolites. The different materials in environment were source for pentose-assimilating yeast with variable metabolic profile.

Selection of Xilose-Fermenting Yeast Strains

ABSTRACT In Brazil, ethanol is obtained by fermentat of sugar cane juice using Saccharomyces cerevisiae. The cane juice extraction generates the bagasse that has been used for obtaining generation biofuel. However, the sugarcane bagasse has 30% pentose that cannot be fermented to ethanol by S. cerevisiae. Thus the aim of this study was to isolate a yeast able to ferment xylose to ethanol. Samples of cane juice and flowers were used for the isolation of 165 strains that were then screened for ethanol production using plate testing. Among them, the ethanol positive strains Wickerhamomyces anomalus, Schizosaccharomyces pombe and Starmerella meliponinorum were selected for a xylose fermentation assay, using a semi-synthetic and bagasse hydrolysate as must. S. meliponinorum and S. pombe produced 0.63 and 2.7 gL-1 of ethanol, respectively, from xylose in a semisynthetic medium. In the medium consisting of bagasse hydrolysate must, 0.67 and 1.1 gL-1 of ethanol were obtained from S. meliponinorum and S. pombe, respectively. All the yeasts produced xylitol from xylose in the semisynthetic medium and S. meliponinorum was that which produced the highest quantity (14.5 g L-1).

Selection of thermophilic and thermotolerant fungi for the production of cellulases and xylanases under solid-state fermentation

Twenty-seven thermophilic and thermotolerant fungal strains were isolated from soil, decaying organic matter and sugarcane piles based on their ability to grow at 45ºC on medium containing corn straw and cardboard as carbon sources. These fungi were identified in the genera Aspergillus, Thermomyces, Myceliophthora, Thermomucor and Candida. The majority of the isolated strains produced xylanase and cellulases under solid state fermentation (SSF). The highest cellulase and xylanase productions were obtained by the cultivation of the strains identified as Aspergillus fumigatus M.7.1 and Myceliophthora thermophila M.7.7. The enzymes from these strains exhibited maximum activity at pH 5.0 and at 60 and 70ºC. The endo-glucanase from A. fumigatus was stable from 40ºC to 65ºC and both endo-glucanase and xylanase from M. thermophila were stable in this temperature range when in absence of substrate. The enzymes were stable from pH 4.0 to 9.0.

Selection of thermophilic and thermotolerant fungi for the production of cellulases and xylanases under solid-state fermentation.

Twenty-seven thermophilic and thermotolerant fungal strains were isolated from soil, decaying organic matter and sugarcane piles based on their ability to grow at 45°C on medium containing corn straw and cardboard as carbon sources. These fungi were identified in the genera Aspergillus, Thermomyces, Myceliophthora, Thermomucor and Candida. The majority of the isolated strains produced xylanase and cellulases under solid state fermentation (SSF). The highest cellulase and xylanase productions were obtained by the cultivation of the strains identified as Aspergillus fumigatus M.7.1 and Myceliophthora thermophila M.7.7. The enzymes from these strains exhibited maximum activity at pH 5.0 and at 60 and 70ºC. The endo-glucanase from A. fumigatus was stable from 40°C to 65°C and both endo-glucanase and xylanase from M. thermophila were stable in this temperature range when in absence of substrate. The enzymes were stable from pH 4.0 to 9.0.

Ligninases production by Basidiomycetes strains on lignocellulosic agricultural residues and their application in the decolorization of synthetic dyes / Produção de ligninases por linhagens de fungos Basidiomicetos usando resíduos agrícolas lignocelulósicos e aplicação das enzimas na descoloração de corantes sintéticos

Wood rotting Basidiomycetes collected in the ôEstação Ecológica do Noroeste Paulistaõ, São José do Rio Preto, São Paulo State, Brazil, concerning Aphyllophorales order and identified as Coriolopsis byrsina SXS16, Lentinus strigellus SXS355, Lentinus sp SXS48, Picnoporus sanguineus SXS 43 and Phellinus rimosus SXS47 were tested for ligninases production by solid state fermentation (SSF) using wheat branor rice straw as culture media. C. byrsina produced the highest laccase (200 U mL-1) and Lentinus sp produced the highest activities of manganese peroxidase (MnP) and lignin peroxidase (LiP) (7 and 8 U mL-1, respectively), when cultivated on wheat bran. The effect of N addition on enzyme production was studied in medium containing rice straw and the data showed an increase of 3 up to 4-fold in the laccase production compared to that obtained in SSF on wheat bran. The laccases presented optimum pH at 3.0-3.5 and were stable at neutral pH values. Optimum pH for MnP and LiP activities was at 3.5 and between 4.5 and 6.0, respectively. All the strains produced laccase with optimum activities between 55-60ºC while the peroxidases presented maximum activity at temperatures of 30 to 55ºC. The crude enzymes promoted decolorization of chemically different dyes with around 70% of decolorization of RBBR and cybacron blue 3GA in 6h oftreatment. The data indicated that enzymes from these basidiomycetes strains are able to decolorize synthetic dyes.

Fungos decompositores de madeira, do grupo Basidiomicetes, coletados na ôEstação Ecológica do NoroestePaulistaõ, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil, pertencentes a ordem Aphyllophorales e identificados como Coriolopsis byrsina SXS16, Lentinus strigellus SXS355, Lentinus sp. SXS48,Picnoporus sanguineus SXS 43 e Phellinus rimosus SXS47 foram estudados para a produção de ligninases por FES (fermentação em estado sólido) usando farelo de trigo ou palha de arroz como meio de cultura. A espécie C. byrsina produziu a maior quantidade de lacase (200 U mL-1) enquanto que Lentinus sp. foi o melhor produtor de manganês peroxidase (MnP) e lignina peroxidase (LiP) (7 e 8 U mL-1, respectivamente), quando cultivados em meio composto por farelo de trigo. A avaliação do efeito da suplementação de nitrogênio do substrato sólido lignocelulósico (palha de arroz) indicou um aumento de 3 a 4 vezes na produção de lacase. A caracterização das enzimasmostrou que as lacases apresentaram atividade ótima em pH 3,0-3,5 e foram estáveis em pH de neutro a alcalino. O pH ótimo para atividade de MnP e LiP foi de 3,5 e entre 4,5 e 6,0, respectivamente. Todas as linhagens produziram lacase com atividade ótima a 55-60ºC, enquanto as peroxidases apresentaram atividades máximas entre temperaturas de 30 e 55ºC. A aplicaçãodas soluções enzimáticas brutas, obtidas pelo cultivo das linhagens em meio de farelo de trigo, em testes de descoloração de corantes sintéticos de diferentes grupos químicos levou amais 70% de perda de cor dos corantes RBBR e de cybacron blue 3GA, em 6h de tratamento. Os dados obtidos indicaramque as soluções enzimáticas contendo ligninases produzidas pelas linhagens de basidiomicetos estudadas promoveram adescoloração de corantes sintéticos.

Localization and partial characterization of thermostable glucoamylase produced by newly isolated Thermomyces lanuginosus TO3 in submerged fermentation

Thermophilic Thermomyces lanuginosus strain TO3 was isolated from compost pile samples and was used for its ability to produce considerable glucoamylase activity when growing in liquid medium at 45ºC with starch as the sole carbon source. Enzyme productivity was high in submerged fermentation (SmF) with maximum activity of 13 U/mL after 168 h of fermentation. Higher quantities of glucose were released when the substrate for enzyme was soluble starch than maltose or maltooligosaccharides were used. The distribution of glucoamylase between the extracellular and cell-associated fractions varied according to fermentation time. Glucoamylase produced from T. lanuginosus TO3 had optimum activity at 65 ºC and good thermostability in the absence of substrate, with a half-life of 6 h at 60 ºC. The enzyme was stable over a wide pH range (4.0-10.0).

O fungo termofílico Thermomyces lanuginosus TO3 foi isolado a partir de amostras de material de pilhas de compostagem, com base em sua capacidade de crescer em meio líquido contendo amido como única fonte de carbono, a 45 ºC, e produzir considerável quantidade de glucoamilase. A produção da enzima por fermentação submersa FSm foi alta, com um máximo de 13 U/mL em 168 h de fermentação. A atividade enzimática foi maior sobre amido do que sobre a maltose e maltooligosacarideos. As atividades de glucoamilase extra e intracelular variaram com o tempo de fermentação. A glucoamilase produzidas por T. lanuginosus TO3 apresentou elevada temperatura ótima de atividade (65 -70 ºC) com boa termoestabilidade em ausência de substrato, apresentando uma meia vida de 6 h a 60ºC, além de estabilidade em ampla faixa de pH. Os resultados apresentados indicam uma importante fonte alternativa de glucoamilase para uso no processamento industrial de amido.

Production and characterization of glucoamylase from fungus Aspergillus awamori expressed in yeast Saccharomyces cerevisiae using different carbon sources

Glucoamylase is widely used in the food industry to produce high glucose syrup, and also in fermentation processes for production beer and ethanol. In this work the productivity of the glucoamylase of Aspergillus awamori expressed by the yeast Saccharomyces cerevisiae, produced in submerged fermentation using different starches, was evaluated and characterized physico-chemically. The enzyme presented high specific activity, 13.8 U/mgprotein or 2.9 U/mgbiomass, after 48 h of fermentation using soluble starch as substrate. Glucoamylase presented optimum activity at temperature of 55ºC, and, in the substratum absence, the thermostability was for 1h at 50ºC. The optimum pH of activity was pH 3.5 - 4.0 and the pH stability between 5.0 and 7.0. The half life at 65ºC was at 30.2 min, and the thermal energy of denaturation was 234.3 KJ mol-1. The hydrolysis of different substrate showed the enzyme's preference for the substrate with a larger polymerization degree. The gelatinized corn starch was the substratum most susceptible to the enzymatic action.

A glucoamilase é amplamente utilizada na indústria de alimentos no processamento do amido para a produção de xarope com alto teor de glicose e também muito empregada nos processos de fermentação para produção de cerveja e etanol. Neste trabalho a glucoamilase de Aspergillus awamori expressa em Saccharomyces cerevisiae produzida sob fermentação líquida foi avaliada quanto à produtividade em diferentes amidos e caracterizada físico-quimicamente. A enzima apresentou alta atividade específica de 13,8 U/mg proteína e de 2,9 U/mg biomassa ao final de 48 h de fermentação em meio contendo amido solúvel. A glucoamilase apresentou temperatura ótima de atividade a 55ºC, e temperatura de desnaturação térmica na ausência de substrato por 1h a 50ºC. O pH ótimo de atividade foi na faixa de 3,5 - 4,0 e a estabilidade ao pH entre os valores 5,0 e 7,0. A meia vida a 65ºC foi 30,2 min., e a energia de desnaturação foi de 234.3 KJ mol-1. A hidrólise em diferentes substratos mostrou a preferência da enzima pelos substratos com maior grau de polimerização, sendo o amido de milho gelatinizado o substrato preferencial à ação enzimática.

Production and partial characterization of polygalacturonases produced by thermophilic Monascus sp N8 and by thermotolerant Aspergillus sp N12 on solid-state fermentation

Polygalacturonases production by newly isolated Monascus sp N8 and Aspergillus sp N12 strains was carried out in solid-state fermentation using mixtures of wheat bran, sugar cane bagasse and orange bagasse as carbon sources. The maximal activity values of exo-polygalacturonases (exo-Pg) from Monascus sp and Aspergillus sp were obtained using wheat bran/sugar cane bagasse/orange bagasse mixture (6.6 U/mL) and wheat bran/orange bagasse mixture (10 U/mL), respectively. Enzyme production by both strains was higher at 45°C after 72 h and 1.6 U/mL at 50°C after 120 h. Endo-polygalacturonase (endo-Pg) production was higher in wheat bran/orange bagasse mixture and was not affected by temperature of incubation for both fungi. Endo-Pg production by Monascus was 1.8 U/mL at 45°C and 50°C, after 72. Similar values were obtained in Aspergillus sp culture, 1.9 U/mL at 45°C and 1.8 U/mL at 50°C. Exo-Pg from both strains showed optimum activity at pH 5.5. Maximal activity was determined at 60°C for enzyme from Monascus sp and 50°C for that produced by Aspergillus sp. Exo-Pg from Monascus sp was stable at pH range 4.5-6.0 whereas that from Aspergillus sp enzyme was stable at pH 4.0. Both enzymes showed stability when incubated at 50°C for 1 h, in absence of substrate.

A produção de poligalacturonases pelas linhagens fúngicas recentemente isoladas, Monascus sp N8 e Aspergillus sp N12, foi estudada através de fermentação em estado sólido usando como substratos misturas de farelo de trigo, bagaço da cana-de-açúcar e bagaço de laranja. A atividade máxima de exo-Pg produzida por Monascus sp (6,6 U/mL) foi obtida quando o meio de cultivo utilizado continha mistura de farelo de trigo, bagaço da cana-de-açúcar e bagaço de laranja (1:1:1), enquanto que Aspergillus sp produziu maior quantidade da enzima (10 U/mL) em meio de farelo de trigo e bagaço de laranja. A maior produção de exo-Pg foi obtida através de incubação das culturas a 45°C quando comparadas àquelas incubadas a 50°C. A produção de endo-poligalacturonase (endo-Pg) pelas duas linhagens não foi afetada pela temperatura de incubação. A atividade de endo-Pg em meio de cultura Monascus sp foi 1.8 U/mL a 45°C em 72 hs de fermentação e 1,6 U/mL a 50°C em 120 hs de fermentação nas mesmas condições. Valores semelhantes foram obtidos pelo cultivo de Aspergillus sp com 1.9 U/mL a 45°C a 1.8 U/mL at 50°C. As exo-poligalacturonases produzidas por ambas as linhagens mostraram maiores atividades em pH 5,5. Enzimas de Monascus sp foi mais ativa a 60°C e a de Aspergillus sp, a 50°C. A exo-Pg produzida por Monascus sp foi estável em valores de pH entre 4,5-6,0, enquanto a de Aspergillus sp foi estável somente em pH 4,0. Ambas as enzimas mostraram-se estáveis por 1 hora a 50°C, quando incubadas em ausência de substrato.

Production of xylanase and CMCase on solid state fermentation in different residues by Thermoascus aurantiacus miehe

O emprego de residuos como matéria prima é importante como estrategia governamental e para o balanco ambiental. O propósito deste trabalho foi estudar a producão de CMCase e xilanase de uma linhagem de Thermoascus aurantiacus isolado de solo brasileiro em fermentacão em estado sólido (SSF) usando diferentes resíduos agrícolas (farelo de trigo, bagaco de cana, bagaco de laranja, sabugo de milho, grama verde, grama seca, serragem de eucalipto e palha de milho) como substratos sem enriquecimento dos meios e caracterizar as enzimas. O estudo das enzimas hemiceluloliticas extracelulares mostrou que o fungo T. arantiacus é mais xilanolítico do que celulolítico. Ele produziu maiores níveis das enzimas em meios contendo sabugo de milho, grama e palha de milho. Todas as enzimas foram estáveis por 24 h à temperatura ambiente numa ampla faixa de pH (3,0 ù 9,0) e também foram estáveis a 60ºC por 1 h. O pH ótimo e temperatura ótima para xilanase e CMCase foram 5,0ù 5,5 e 5,0 e 75ºC, respectivamente. O microrganismo cresceu muito bem estacionariamente no meio simples, de baixo custo. As enzimas estáveis secretadas extracelularmente apresentam as características necessárias para sua aplicacão industrial.

Production of thermostable glucoamylase by newly isolated Aspergillus flavus A 1.1 and Thermomyces lanuginosus A 13.37

Entre 13 linhagens de fungos filamentosos isolados a partir de amostras de solo agrícola, tubérculos e de material em compostagem, duas foram selecionadas em função da capacidade de crescer em meio líquido contendo amido como única fonte de carbono, a 45ºC, e produzir consideráveis quantidades de glucoamilase. Essas linhagens, identificadas como Aspergillus flavus A1.1 e Thermomyces lanuginosus A13.37, foram utilizadas para desenvolvimento de experimentos para avaliar os efeitos do tipo de amido (milho e mandioca), do pH inicial do meio de cultura (4,0; 5,0 e 6,0) e da temperatura de incubação (40 e 45ºC), em um modelo fatorial (2x3x2), sobre a produção da glucoamilase. O tipo de amido usado como fonte de carbono para o cultivo dos fungos influenciou significativamente a produção de glucoamilase por A. flavus, sendo obtida uma maior quantidade da enzima em meio contendo amido de mandioca do que em meio com amido de milho. A produção da enzima por T. lanuginosus também foi maior em meio contendo amido de mandioca, porém, a diferença não foi estatisticamente significativa. As atividades enzimáticas sobre amido (0,3 per center), maltose (0,3 per center) ou sobre mistura de 0,3 per center de amido com 0,1 per center de maltose, indicaram que as enzimas de Aspergillus hidrolisaram, preferencialmente, o amido, embora tenham mostrado atividade considerável sobre a maltose. A maior liberação de glicose a partir da mistura de substratos sugeriu que o fungo em questão possa secretar dois tipos diferentes de enzimas. Enzimas produzidas por T. lanuginosus hidrolisaram o amido e a maltose e não liberaram maiores teores de glicose quando o substrato constou de mistura de amido e maltose. As enzimas de Aspergillus e Thermomyces apresentaram elevada temperatura ótima de atividade (65 e 70ºC, respectivamente) com boa termoestabilidade na ausência de substrato (manutenção de 50 per ceter da atividade por 5 e 8h respectivamente), além de estabilidade em ampla faixa de pH. Os resultados apresentados indicam uma importante fonte alternativa de glucoamilase para uso no processamento industrial de amido.

Pectinase production by fungal strains in solid-state fermentation using agro-industrial bioproduct

A produção de pectina liase e poligalacturonase por linhagens de fungos filamentosos isoladas, foi estudada através de fermentação em estado sólido utilizando subprodutos agro-industriais. Os fungos Moniliella sp SB9 e Penicillium sp EGC5 produziram consideráveis quantidades de PG e PL em substrato composto por mistura de bagaço de laranja, bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo (1:1:1). As enzimas PG e PL, produzidas por Moniliella sp, apresentaram atividades ótimas em pH de 4,5 e 10,0 e em temperaturas de 55°C e 45°C, respectivamente. As mesmas enzimas, produzidas por Penicillium sp apresentaram atividades ótimas em pH 4,5-5,9 e 9,0 e 40°C, respectivamente.

Screening of bacterial strains for pectinolytic activity: characterization of the polygalacturonase produced by "Bacillus" sp

One hundred sixty eight bacterial strains, isolated from soil and samples of vegetable in decomposition, were screened for the use of citrus pectin as the sole carbon source. 102 were positive for pectinase depolymerization in assay plates as evidenced by clear hydrolization halos. Among them, 30(per cent) presented considerable pectinolytic activity. The cultivation of these strains by submerged and semi-solid fermentation for polygalacturose production indicated that five strains of "Bacillus" sp. produced high quantities of the enzyme. The physico-chemical characteristics, such as optimum pH of 6.0-7.0, optimum temperatures between 45ºC and 55ºC, stability at temperatures above 40ºC and in neutral and alkaline pH, were determined

Ribonuclease production by Aspergillus species

Ribonuclease production by Aspergillus flavipes, A. sulphureus And A. fischeri in semisynthetic medium, after 24-144 hours at 30§C under shaking, was studied. After cultivation, the medium was separated from micelia by filtration and the resultant solution was used as enzymatic extract. The highest amount of biomass and RNase was obtained after 96 hours of cultivation. The enzymes produced by three species presented similar characteristics, with optimum temperature at 55§C and two peaks of activity at pH 4.5 and 7.0. A. flavipes RNases were more sensitive to temperatue: 50(per cent) of the initial activity was lost after 1 hour at 70§C. After this heat treatment, RNase of A. sulphureus lost 30(per cent) of this activity and that of A. fischeri only 16(per cent). The nucleotides released by enzimatic hydrolysis of RNA were separated by ion exchange chromatography in a AG-1X8-formiate column and identified by paper chromatography. This procedure indicated that the raw enzymatic extract of Aspergillus flavipes is able to hydrolyze RNA, releasing 3'-nucleotides monophosphate at pH 4.5 and 3'and 5'-nucleotides monophosphate at pH 7.0 and 8.5. This result suggests that this strain produces two different types of RNase, one acidic and other alcaline, with different specificities

Purification and characterization of thermostable xylanases from thermophilic Humicola sp. and their application in pulp improvement

A linhagem termófila Humicola sp., que foi isolada de madeira em decomposiçäo, produz xilanases extracelulares termoestáveis a 50oC. As xilanases foram purificadas e foram encontradas 3 fraçöes de proteínas com atividade de xilanase. As características das 3 xilanases foram estudadas. Verificou-se que a xilanase I é uma endoxilanase; a xilanase II é uma xilosidase (exoxilanase) enquanto que a xilanase III é uma endoxilanase que também apresenta atividade de arabinosidase e CMCase. O tratamento da polpa "Kraft" branqueada obtida de eucalipto com enzima purificadas e bruta aumentou o brilho da polpa quando comparada com a polpa sem este tratamento. Xilanase I e xilanase bruta aumentaram a viscosidade da polpa enquanto xilanase II e III diminuíram a viscosiddade devido à presença de atividade CMCase